利用近红外标记和先进的图像及数据分析提高Cell Painting的可靠性

　　基于图像的表型分析方法，如广泛使用的Cell Painting分析，使用高内涵成像和多参数输出来研究细胞中的生物、遗传和化学扰动。这种日益流行的方法正被应用于从药物发现项目到基因组筛选研究。

　　在标准的Cell Painting实验中，各种细胞器和结构(细胞核、细胞质、线粒体、高尔基体、内质网、细胞骨架、胞质RNA和核仁)在5个成像通道中被采集。这种广泛的细胞染色能够以单细胞分辨率对多种形态的扰动进行监测和定量。已发表的Cell Painting分析的局限性包括适合的染料可用性狭窄以及成像系统提供足够的光谱分离能力。具体来说，高尔基体和肌动蛋白是通过同一通道成像的，这就给图像分析中区分这两个结构带来了挑战。这种限制可能会干扰hit的选择或掩盖某些化合物的效果，特别是那些具有影响高尔基体(生物合成途径)或细胞骨架网络的作用机制(MOA)的化合物。

　　优势

　　1、使用近红外标记提高Cell Painting分析的灵敏度。

　   2、使用IN Carta的深度学习SINAP模块获得可靠的图像分割。

　　3、结合StratoMineR的基于云的数据分析软件易于使用。

　　在这里，我们试图利用配备近红外光源的ImageXpress Confocal HT.ai高内涵成像系统来改进检测方法。我们将Alexa Fluor 568 Phalloidin替换为Alexa Fluor 750 Phalloidin，使细胞骨架与高尔基区域明显分离。

　　由于这种多色分析的复杂性，从这些图像分析中产生的庞大数据需要额外的分析工具来帮助挖掘和解释数据。为了便于管理图像和数据分析，我们使用IN Carta图像分析软件进行特征提取，然后使用HC StratoMineR进行数据挖掘和分析。IN Carta具有深度学习功能，允许更可靠的特征分割。因此，当与深度学习的SINAP模块一起使用时，Cell Painting分析将受益于改进的细胞核检测。此外，如线粒体、内质网、高尔基体和细胞骨架等细胞器可以在需要时使用深度学习功能进一步分割。可以从分析的图像中提取包含荧光强度、空间数值、纹理、细胞器分布和共定位测量。然后将数据上传到HC StratoMineR，这是一个直观的基于云的数据分析平台，用于进一步的数据分析。为了确定我们的方法是否比标准的Cell Painting方法有任何优势，我们比较了用5通道获得的图像和用6通道获得的图像之间的表型距离得分。

　　我们发现，用一组化合物处理的细胞的距离得分提高了49%。这些结果表明，对高尔基体和细胞骨架使用单独的成像通道增加了Cell Painting实验的敏感性，并更有力的代表了不同的细胞表型特征。

　　方法

　　1.U2OS细胞(ATCC)以每孔2000个细胞接种。

　　2.在四个复孔中，以7个数据点1：3系列稀释和合适的对照品对11种化合物进行了测试。使用的化合物：Ca-074-Me、CCCP、氯喹、细胞松弛素D、依托泊苷、拉春库林B、雷帕霉素、鱼藤酮、十字孢碱、紫杉醇、粉防己碱。

　　3.细胞染色采用Bray等人的方法1。对于改进的方案，使用phalloidin/Alexa Fluor Plus 750(Thermo Fisher)代替phalloidin/Alexa Fluor 568。

　　4.图像采集在使用20X Plan Apo物镜的ImageXpress Confocal HT.ai(基于激光)或者ImageXpress Micro Confocal(基于LED)的高内涵成像系统(Molecular Devices)上进行。使用的滤光片如表1所示。

　　5.图像分析采用IN Carta图像分析软件。所选择的测量包括与强度、纹理、形状、空间关系和共定位分数相关的参数。

　　6.细胞水平的数据被上传到StratoMineR(https://cla.stratominer.com/index.php,Core Life Analytics)进行进一步的数据分析。简要地说，采用了质量控制、孔归一化、数据转换和特征标准化。使用主成分分析(PCA)对数据集进行降维。进一步的下游分析，如进行基于主成分和表型距离得分的hit选择和聚类分析。

　　基于图像分析的工作流程概述。

　　上面列出了每个步骤的详细信息。

　　结果

　　图像采集

　　Cell Painting实验使用六种荧光标记同时标记细胞，然后对各种细胞结构进行成像。高尔基体(AGP通道)和细胞骨架均使用相同的滤光片组成像(表1，图1)。这些亚细胞结构的解析通常在图像分析步骤中进行。在我们的模型实验中，用11种化合物处理U2OS细胞24小时，然后再根据之前发表的方法进行。1、2然后使用5个成像通道对细胞进行成像(图1)。

　　为了从细胞骨架中分离出高尔基体结构，我们修改了检测方法，将Alexa Fluor 568 Phalloidin换成Alexa Fluor 750 Phalloidin，并使用配备了近红外光源的ImageXpress Confocal HT.ai高内涵成像系统对细胞进行成像(图2A)(以下简称改进的检测)。用这种方法，可以在未经处理的细胞中清楚地看到高尔基体结构在核周分布。当WGA(高尔基体)和鬼笔环肽(肌动蛋白)染色在同一通道成像时，这种分布不易区分(图1)。这种差异在化合物(如粉防己碱)处理的细胞中更为明显(图2B)。

　　图1 Cell Painting检测。细胞染色的例子，Cell Painting实验使用以前发表的方法。值得注意的是高尔基体和肌动蛋白结构是在同一个通道(AGP)中采集的。肌动蛋白染色表现为丝状结构。然而，高尔基体是不容易被眼睛区分的。

　　表1用于Cell Painting实验的染料和

　　用于细胞区域检测的滤光片组。

　　图2 Cell Painting实验改进使用远红外光源的改良方案，以改善Cell Painting实验中的光谱分离。A)Phalloidin Alexa Fluor 750用于在改良方案中标记肌动蛋白。显示了来自对照孔的示例图像。插图(白色框)被放大，显示为细胞核(蓝色)和高尔基体通道(黄色)的合成图。高尔基斑点明显分布在核周组织中。B)细胞用粉防己碱处理的图像。左边是肌动蛋白和高尔基体通道叠加的重建图像(黄色)。右边显示只有高尔基体(黄色)和细胞核(蓝色)的图像。改良方案中粉防己碱对高尔基体分布的影响更为明显(右)。C)激光光源及其相对功率显示。标示展示了各个光源检测的细胞区域。

　　特征提取和数据分析

　　为了量化标准cell paint染料组与改良染料组染色的细胞之间的差异，在IN Carta图像分析软件中分析图像(图3)。提取的测量数据上传到HC StratoMineR进行进一步的数据分析。从标准Cell Painting实验与改良实验提取的数据执行主成分分析(PCA)。有趣的是，AGP通道的测量构成了PCA 1中5通道图像的大部分特征成分。然而，肌动蛋白通道的测量构成了PCA 1中改良后的6通道图像的大部分主要特征(图4)。这表明，改进的分析方法可以提高肌动蛋白和高尔基体组分之间的表型图谱的分辨率，这对了解MOA是有用的。

　　我们还根据距离评分比较了标准和改良Cell Painting实验之间的表型特征。该分数表示一个样本与阴性对照之间的表型距离，可用于筛选实验中的hit选择。我们发现已知影响高尔基体通路的化合物的距离分数有所增加(表2)。这些结果表明，对高尔基体和细胞骨架使用单独的成像通道增加了Cell Painting实验的敏感性，并更有力地代表了细胞表型特征。

　　图3在IN Carta软件中进行特征提取，对各种细胞结构进行分割。在这里，内置的细胞核模型被用来在所有处理中实现核的稳定分割。对于6通道采集的图像，每个细胞提取487个特征。这里展示的是在IN Carta软件中带有特征掩模叠加的示例图像。

　　表2使用Cell Painting的5通道和6通道获取

　　的数据集之间的距离分数的变化。

　　图4使用HC StratoMineR进行数据分析。A)HC StratoMineR是一个基于网页的平台，引导用户通过一个典型的工作流分析高内涵的多参数数据。B)用PCA(广义加权最小二乘法)将数据减少到15个成分。特征对PCA1的贡献显示为一个极线图。根据它们所代表的细胞区域，用特征颜色编码。PCA1特征从5通道(上)和6通道(下)Cell Painting采集。请注意特性的贡献有所不同。

　　总结

　　我们的结果表明，使用近红外激光提高了Cell Painting检测的灵敏度。在这种情况下，它允许开发一种分离高尔基体表型更敏感的分析方法。

　　额外的通道还允许通过添加项目特定的生物标记物来扩展标准的Cell Painting分析。

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